Mise au point d’une méthode de culture du norovirus humain

Les norovirus humains sont fortement impliqués dans les gastroentérites aiguës de l’Homme. L'établissement d'un système de culture cellulaire in vitro efficace pour ce norovirus restait un défi ; la réplication du norovirus humain (HuNoV) a toutefois déjà été rapportée dans des cellules Caco-2 et dans un clone de cellules Caco-2 (C2BBe1) cultivés en 3D, dans des entéroïdes humains et dans des cellules B humaines. Les villosités intestinales isolées de souris sont un modèle cellulaire primaire qui a déjà permis l'infection et la réplication du rotavirus ; et toute la diversité des cellules épithéliales intestinales se trouve dans les villosités. Nous avons émis l'hypothèse qu'elles pourraient permettre l'infection et la réplication du norovirus humain. Dans notre étude, nous montrons que le modèle de villosités isolées de l'intestin de souris est efficace pour l'étude de l'infection et de la réplication du norovirus humain à partir de fèces et de matrices environnementales (eau, légumes et air). Pour infecter, le virus doit être activé avec de la trypsine et a un cycle de réplication moyen de 10 h, bien que des particules virales avec une capacité infectieuse soient trouvées à partir de 2 heures après l'infection. Le modèle est efficace pour obtenir un matériel biologique abondant et est idéal pour étudier l'activité biologique du norovirus humain dans le même modèle cellulaire ou pour générer des anticorps.

Contexte et enjeux :

• Les gastroentérites aiguës touchent chaque année 1/3 de la population française . Elles sont majoritairement d’étiologie virale, et résultent pour beaucoup d’infections à norovirus. Ces derniers peuvent être transmis directement ou indirectement par les aliments, l’eau, les surfaces inertes et l’air. Les aliments concernés incluent par contribution décroissante les légumes-feuilles mangés crus, les fruits/noix et les fruits de mer. Les norovirus humains sont la première cause d’épidémies et de maladies associées à la consommation de légumes-feuilles ;
• Les norovirus humains sont généralement suivis par des méthodes comme la RT-qPCR (biologie moléculaire) qui permet de dénombrer des copies de gènes sans indiquer l’infectiosité des virus, mais on fait souvent l’hypothèse que peu de virus seraient infectieux ;
• L’utilisation de virus cultivables mimant le comportement du norovirus humain (norovirus murin, virus tulane, calicivirus félins …) aboutit à des comportements pouvant différer de ceux du norovirus humains (notamment à cause d’épitopes (récepteurs) différents) ;
• Toutes les tentatives antérieures de mise en culture du norovirus humain ont plus ou moins échoué.

Résultats :

• La méthode de culture proposée utilise des villosités intestinales isolées de souris comme modèle cellulaire infectable par les norovirus humains. Le virus est « activé » en attaquant sa protéine de structure VP1 au moyen de trypsine, mimant le fonctionnement du tube digestif et rendant surement plus accessibles certains des épitopes présents au sommet des protéines VP1 ;
• Les villosités ont permis de cultiver des norovirus humains, suggérant d’une part qu’il y a dans ce modèle cellulaire tous les récepteurs requis par les norovirus humains ou que ces derniers partagent certains récepteurs avec les norovirus de souris, d’autre part que ce modèle cellulaire possède toute la machinerie biochimique pour la réplication du virus ;
• Ce modèle cellulaire a permis la réplication du norovirus humain pour la plupart les échantillons fécaux et environnementaux (eau, légumes-feuilles, air) qui étaient positifs à ce virus par RT-qPCR et/ou immunodot-blot dans notre étude (36 échantillons sur 40) ;
• Cela suggère une grande sensibilité de la méthode, et que la plupart des norovirus détectés par d’autres méthodes seraient infectieux.

Perspectives :

• Application directe : produire en grande quantité des norovirus humains au lieu de surrogates dans les études de processus, et faire des tests sur l’infectiosité d’échantillons (positif/négatif) ;
• Dans le domaine médical : utiliser ce modèle cellulaire et notre méthode pour étudier des processus importants non encore compris tels que (i) les récepteurs cellulaires, (ii) les mécanismes d'entrée du virus dans la cellule et la biochimie du processus infectieux, et (iii) les modes d’action des médicaments qui inhibent le processus infectieux ;
• Dans le domaine environnemental : passer du caractère positif/négatif d’un échantillon au dénombrement des virus infectieux soit en couplant la méthode à un protocole MPN (Most Probable Number), soit en identifiant les cellules infectées dans les villosités intestinales de souris pour les cultiver séparément et arriver à des comptages de plages de lyse (avec probablement la nécessité de trouver une souche cancéreuse de cellules).